小鼠环磷酸鸟苷（cGMP）ELISA试剂盒使用说明书

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本试剂仅供科研使用，不得用于医学诊断

实验目的：

本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中环磷酸鸟苷（cGMP）的含量。

实验原理：

本试剂盒应用于双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被环磷酸鸟苷（cGMP）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的环磷酸鸟苷（cGMP）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

试剂盒组成：

注：标准品浓度依次为：0、3、6、12、24、48 nmol/L

需自备的试剂和器材：

1. 酶标仪（450nm）

2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒温箱

4. 蒸馏水或去离子水

样本处理及要求：

1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

操作步骤：
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL。

3.加样：在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

4.加酶：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL。用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.温育：用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60分钟。
6.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

7.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置1分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复5次（也可用洗板机洗板）。

7. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟. 

8. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

9. 测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

计算：

以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，    

在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD      

值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释      

倍数；或用标准品的浓度与OD值计算出标      

准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值      

代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释      

倍数，即为样品的实际浓度。 

（此图仅供参考）

注意事项：

1.浓缩洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

2.各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样，所有液体组分，使用前充分摇匀。

3.请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。

4.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染， 底物请避光保存。

5.严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

6.所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

7.本公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量，预留充足的样本。

8.若样本为细胞培养上清，因该类样本干扰因素较多，如：细胞状态、细胞数量、采样时间等，所以可能存在检测不出的情况。

试剂盒性能：

1.样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990以上。

2.批内变异系数与批间变异系数应分别小于10%和15% 。
3.检测范围：1.5 nmol/L – 48 nmol/L
4.最低检测浓度小于0.1 nmol/L
5.特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
6.重复性：板内、板间变异系数均小于15%。

7.贮藏：2-8℃，避光防潮保存。
8.有效期： 6个月

风险说明：
1.试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。
2.严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。

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